实验概要
实验原理
多聚酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性、退火、延伸三个基本反应步骤构成。
1. 模板DNA的变性:模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;
2. 模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;
3. 引物的延伸:DNA模板-引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性、退火、延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟, 2~3小时就能将待扩增的目的基因扩增放大几百万倍。
典型的PCR反应体系由如下组分组成:DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl 2 、两个合成的DNA引物、耐热 Taq聚合酶。
除了典型的PCR外,人们还根据各种用途设计了各种不同的PCR。如:
RT-PCR,即在mRNA反转录之后进行的PCR。
反向PCR,常规PCR允许扩增两引物之间的DNA区段,而反向PCR则可以对靶DNA区段之外的两侧未知的DNA序列进行扩增。
不对称PCR,常规PCR使用的引物浓度相同,而不对称PCR使用的引物浓度不同,两种引物浓度相差100倍。在最初20各循环中,主要产物是双链DNA。当低浓度引物被耗尽后,高浓度引物引导的PCR就会产生大量单链DNA,单链DNA可用于序列测定。
主要试剂
1. DNA模板(1ng/μL)(质粒R-pGEX-4T-1,R指代外源基因)
2. 2.5mmol/LdNTP (TaKaRa)
3. 10×PCR缓冲液(TaKaRa)
4. 25mmol/L MgCl 2 (TaKaRa)
5. 引物1、引物2(5pmol/μL)
相关仪器
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